L'Ordine di Santo Stefano papa e martire venne fondato nel 1516 da Cosimo I de' Medici, Granduca di Toscana, su imitazione degli ordini Gerosolimitani e spagnoli. L'Ordine si proponeva gli obiettivi della salvaguardia della fede e la lotta agli Ottomani e alla pirateria barbaresca che allora infestava il Mediterraneo, soprattutto nel Tirreno dove Cosimo aveva istituito il nuovo porto di Livorno. Prima del 1516, Cosimo aveva fatto altri tentativi di fondazione di un ordine cavalleresco, ma fu solo con l'ascesa al soglio pontificio di papa Pio IV, favorevole ai Medici, che poté essere istituzionalizzato; fu lo stesso papa, infatti, che legittimò l'Ordine con la bolla solenne "His quae" del 1° Febbraio 1562. L'Ordine, che seguiva la regola benedettina, veniva assegnato in Magistero alla casa Granducale di Toscana, con Cosimo I come primo Gran Maestro.
Secondo alcuni, l'intitolazione dell'Ordine venne scelta in seguito alla vittoria che il maresciallo Strozzi riportò sui Francesi contro Siena, il 2 Agosto 1554, giorno di Santo Stefano papa e martire. Secondo altri, fu un'altra vittoria a dare il nome all'Ordine, quella riportata dallo stesso Cosimo a Montemurlo, nel 1° agosto 1537.
Nel 1587, per volere di papa Sisto V, e su richiesta di Francesco I de' Medici, Granduca di Toscana succeduto al padre Cosimo, assorbì l'appena sciolto ordine dei Cavalieri di San Giacomo d'Altopascio, altrimenti detti Cavalieri del Tau, incorporandone i beni.
La prima sede dell'Ordine venne stabilita a Portoferraio, sull'isola d'Elba, ma dopo qualche anno venne trasferita definitivamente a Pisa, nella piazza che oggi porta il loro nome, dove Cosimo I fece edificare da Giorgio Vasari, il suo architetto di fiducia, la Chiesa di Santo Stefano dei Cavalieri.
L'Ordine si distinse nel corso della sua esistenza per numerose campagne militari di successo, che gli storici identificano in tre fasi. Nella prima, cominciata verso il 1570, i Cavalieri si schierarono al fianco della Spagna nella lotta contro l'invasione ottomana, nella difesa di Malta (1565) e nella battaglia di Lepanto (1571), contribuendo con dodici galee alla forza navale schierata dalla Lega Santa, insieme ai Cavalieri di Malta. Nella seconda fase, essi si distinsero nella lotta contro i pirati turchi e barbareschi che infestavano il Mediterraneo; parteciparono ad alcune spedizioni sulle isole del Mar Egeo, alle campagne di Dalmazia e di Negroponte ed alla Guerra di Corfù. La terza fase, iniziata attorno al 1640, vide una progressiva riduzione delle attività belliche a favore di una maggiore opera di rappresentanza e di difesa delle coste. L'ultima azione militare risale al 1719, dopodiché l'Ordine cominciò ad essere modificato. Fu il granduca Pietro Leopoldo alla fine del XVII secolo ad attuare una riforma dell'ordine, modificandone lo statuto e trasformandolo da un ordine militaresco ad uno di formazione per la futura classe dirigente toscana.
L'ordine è sopravvissuto più o meno modificato nello statuto fino al giorno d'oggi, dopo vari tentativi di soppressione andati male e blandi ritocchi allo statuto. L'emblema dell'Ordine è una croce rossa di Malta (nota anche come "Croce delle Otto Beatitudini") bordata di oro in campo bianco, accantonata da gigli in oro. Originariamente era suddiviso in due categorie, i militi e i sacerdoti, cui si affiancavano i serventi (d'arme e di stallo), e ieri come oggi l'accesso era riservato solo a coloro che potevano dimostrare di possedere quattro quarti di nobiltà (cioè nobiltà di tutti i nonni materni paterni). I Cavalieri erano soggetti ai tre voti di castità, carità ed obbedienza dai quali, comunque, potevano essere dispensati dal Gran Maestro.
Cosimo de' Medici, che fu Granduca di Toscana dal 1537 al 1574, ereditò dalla nonna Caterina Sforza la passione per l'Alchimia e per l'esoterismo in genere. Fu lui, infatti, che commissionò la traduzione, prima in latino e poi in volgare, del "Corpus Hermeticum" di Ermete Trismegisto, iniziando la diffusione delle dottrine che dal mitico maestro presero il nome di "ermetiche". Una passione che il Granduca trasmise anche a suo figlio, Francesco I, che è ricordato, tra l'altro, per il famoso studiolo che si fece costruire a Palazzo Vecchio dal Vasari, decorato con immagini simboliche a carattere alchemico, insieme al famoso dipinto di Giovanni Stradano, "Il laboratorio dell'Alchimista".
Cosimo fu anche un grande cultore delle arti e ben lo testimoniano le numerose opere che realizzò per la città di Firenze. Fu lui, infatti, che fece costruire la Galleria degli Uffizi, facendola collegare direttamente alla sua residenza in Palazzo Vecchio tramite il Corridoio Vasariano; ampliò il museo di Palazzo Pitti e portò a compimento il Giardino di Boboli, tipico "luogo delle meraviglie" rinascimentale intriso di elementi simbolici ed esoterici. Prima della fondazione dell'Ordine di Santo Stefano, Cosimo I era stato investito, nel 1546, all'Ordine del Toson d'Oro. Il Toson d'Oro, che prende il nome dal mitico vello aureo oggetto della spedizione degli Argonauti nella mitologia greca, era un ordine dinastico fondato sul modello di quello inglese della Giarrettiera, ma dedicato a Sant'Andrea, fondato in Borgogna da Filippo III, detto il Buono.
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